تحقیقاتی

"هرآنچه که باید درمورد کیت ها بدانید"

کیت آزمایشگاهی چیست ؟

کیت های آزمایشگاهی یا کیت ‌های تحقیقاتی دربردارنده ماده یا ترکیباتی هستند که به منظور غربالگری، تشخیص بیماری‌ها و تعیین روند درمان بیمار با بالاترین کیفیت و بیشترین دقت تولید می‌شوند. هدف کیت‌های تشخیصی در آزمایشگاه‌های بالینی و پاتوبیولوژی‌ها انجام آزمایشات مختلف روی نمونه‌های گرفته شده از بدن انسان مانند خون، ادرار، مدفوع، بافت، بزاق و سایر مایعات بدن برای تعیین وضعیت سلامتی است و هدف کیت‌های تحقیقاتی تسریع روند آزمایشات در انجام پروژه‌های تحقیقاتی می‌باشد.

کیت‌های آزمایشگاهی در تحقیقات علوم زیستی همچون زیست شناسی سلولی و مولکولی، ژنتیک، میکروبیولوژی، بیوشیمی و همچنین در مسیر غربالگری و تشخیص بیماری‌ها و تعیین چگونگی روند درمان، در پروسه کشف و تولید و توسعه داروها و بررسی کاندیدهای بالقوه دارو و بسیاری از آزمایشات دیگر نقش بسزایی دارند.

نحوه عملکرد کیت آزمایشگاهی

نحوه عملکرد کیت های آزمایشگاهی با توجه به نوع آن متفاوت است. عمدتا کیت های آزمایشگاهی با نمونه ادرار، خون،بزاق و … کار میکنند.

برای مثال، برای تشخیص بیماری کرونا، ابتدا چند قطره خون از فرد مشکوک به ویروس گرفته می شود. این خون را در محل مشخصی از کیت قرار می دهند. در مرحله ی بعدی محلولی به نام بافر با استفاده از تجهیزات مخصوص آزمایشگاهی بر روی خون ریخته می شود. پس از دو ساعت نتیجه ی آزمایش با علامتی بر روی کیت مشخص می شود.زمان تشخیص توسط کیت، بستگی به نوع کیت دارد.

همچنین نمونه های دیگری نیز وجود دارند که با استفاده از بزاق دهان، به تشخیص بیماری کرونا کمک میکنند.

انواع کیت آزمایشگاهی

در یک تقسیم بندی کلی، کیت های آزمایشگاهی به دو نوع هستند :

• کیت های تشخیصی
• کیت های تحقیقاتی  

کیت های تشخیصی :

این نوع کیت ها معمولا در آزمایشگاه های بالینی و پاتولوژی کاربرد دارند، ۵ نوع کیت تشخیصی پرکاربرد عبارت اند از:

• کیت آزمایشگاهی تشخیص بارداری:

معمولا بانوان در اولین مرحله برای تشخیص بارداری خود، از کیت های تشخیصی استفاده می کنند. البته این روش خیلی دقیق نیست. این تست با ادرار انجام می گیرد.

• کیت آزمایشگاهی تشخیص بیماری های عفونی:

این نوع کیت ها کاربرد بسیار فراوانی دارند و برای تشخیص بیماری هایی مانند سرخچه، هپاتیت B و C و … به کار گرفته میشوند.

• کیت آزمایشگاهی تشخیص بیماری های قلبی:

یکی از پرکاربرد ترین کیت ها، کیت های تشخیص بیماری قلبی ست. این ابزار بدنه ی چوبی و قطعات الکتریکی دارد و سر آن نانو حسگرهایی دارد که نمونه بزاق فرد روی آن قرار می گیرد.

• کیت آزمایشگاهی تشخیص کرونا:

امروزه به دلیل شیوع کرونا، این نوع کیت به تولید انبوه رسید. این نوع کیت از طریق بزاق، خون و .. بیماری را تشخیص می دهد.

• کیت آزمایشگاهی تست اعتیاد:

استفاده از این نوع کیت، یکی از ساده ترین و سریع ترین تست های تشخیص اعتیاد است. عملکرد این تست ها بر پایه ی تشخیص مواد و داروهایی ست که در ادرار فرد وجود دارد.

کیت های تحقیقاتی :

این نوع کیت ها در علم زیست شناسی کاربرد دارد و بسته به نیاز، انواع مختلفی دارد. مهمترین کیت های تحقیقاتی، کیت های سلولی، مولکولی و ژنتیکی می باشد.

کیت آزمایشگاهی PCR :

تست PCR مخفف ( Polymerase Chain Reaction ) به معنی مجموعه زنجیره واکنش‌های شیمیایی است که یکی از پرکاربرد ترین روش‌ها در علوم زیستی برای تکثیر الگو، تعییین توالی و کلونینگ، موارد تشخیصی و پژوهشی، شناسایی پزشکی قانونی و … می‌باشد. در این روش یک نسخه یا تعداد بسیار کمی از یک ماده ژنتیکی به تعداد بسیار زیاد تکثیر شده و مورد استفاده قرار می‌گیرد. اجزای مورد استفاده در این روش عبارتند از بافر PCR، نوکلئوتیدهای آزاد mgcl، پرایمر F، پرایمر R، آنزیم‌ها، dNTP و آب مقطر هستند و دستگاه مورد استفاده در این روش ترموسایکلر نام دارد که براساس تغییر دما واکنش را پیش می‌برد به این صورت که با استفاده از تغییر دما زنجیره‌ها را از هم باز کرده و سپس آنزیم‌ها را فعال می‌کند و مجددأ با تغییر دما منجر به بهم گره خوردن زنجیره‌ها می‌شود.

کیت آزمایشگاهی الایزا:

این نوع کیت ها قابل استفاده برای مطالعات سلولی می باشد. اساس کار این کیت ها، واکنش بین آنتی ژن و آنتی بادی می باشد.

کیت تست الایزا یکی از رایج ترین و پرکاربرد ترین روش‌ها برای مطالعه سلول است. این آزمایش یک آزمایش ایمونولوژیکی استاندارد و نسبتأ دقیق می‌باشد. همچنین یک روش تشخیص بیومارکرهای بیماری و کنترل کیفیت در صنایع گوناگون است. اساس کار آن بر مبنای واکنش بین آنتی ژن Ag و آنتی بادی Ab اجزای مورد استفاده در آن شامل میکروپلیت‌های الایزا، کونژوگه سوبسترا، کروموژن، صفحات پوشیده شده با آنتی بادی تشخیصی، انواع بافرها و معرف‌ها و محلول‌های شستشو می‌باشد. الایزا به ۴ روش دسته بندی می‌شود که به شرح زیر است

• الایزای مستقیم :

این روش یکی از سریعترین روش‌های الایزا است و شامل مراحل کمتری ( ۶ مرحله ) می‌باشد و همچنین مستعد خطای کمتری است و مراحل آن به این صورت است که آنتی ژن Ag یا آنتی بادی Ab که هدف تحقیق است و باید مورد شناسایی قرار گیرد بطور مستقیم بر سطح فاز جامد ( چاهک میکروپلاته ) کوت می‌شود، مرحله بعد شستشو داده می‌شود و بعد از آن یک انتی ژن Ag یا آنتی بادی Ab مکمل آن که نشاندار شده است وارد محیط شده و سپس باز هم شستشو انجام می‌گیرد در مرحله آخر در صورت مشاهده سیگنال نتیجه بررسی خواهد شد.

• الایزای غیرمستقیم

این روش از روش الایزا مستقیم کمی پیچیده‌تر است و شامل مراحل بیشتر ( ۸ مرحله ) می‌باشد، این روش برای بررسی Ab آنتی بادی اختصاصی علیه یک پاتوژن خاص یا تیتراسیون Ab آنتی بادی در نمونه سرم مورد استفاده قرار می‌گیرد که در آن آنتی ژن Ag یا آنتی بادی Ab مورد نظر در سطح جامد ( چاهک میکروپلاته ) کوت می‌شود و سپس شستشو انجام می‌گیرد، سپس سرم حاوی آنتی بادی Ab به آن اضافه می‌شود و پس از آن آنتی هیومن گلوبولین AHG نشاندار ( Ab ضد پلی کلونال ) که قابلیت اتصال به Ab آنتی بادی مورد نظر را دارد به آن اضافه می‌گردد و باز هم شستشو انجام می‌گیرد و در آخر توسط سیگنال‌های مشاهده شده نتیجه مورد بررسی قرار می‌گیرد.

• الایزای ساندویچی

این روش عمومی‌ترین روش تست الایزا می‌باشد. دراین روش ابتدا یک Ab آنتی بادی در سطح چاهک میکروپلاته کوت می‌شود و سپس Ag آنتی ژن و بعد آن یک Ab آنتی بادی اختصاصی که با آنزیم کونژوگه شده اضافه می‌گردد، در واقع در این مرحله یک آنتی ژن Ag در بین دو آنتی بادی که یکی بر سطح جامد کوت شده و دیگری نشاندار است قرار می‌گیرد سپس انکوباسیون انجام می‌شود و مرحله بعدی مورد شستشو قرار می‌گیرد و در آخر توسط دستگاه الایزاریدر اندازه‌گیری می‌شود.

• الایزای رقابتی

این روش نسبتأ پیچیده است زیرا شامل استفاده از Ag آنتی ژن مهار کننده است، در این روش اساس سنجش بین ۲ آنتی ژن Ag و ۲ آنتی بادی Ab که یکی از آن دو نشان دار است برسر اتصال به لیگاند با مقدار محدود می‌باشد.

کیت آزمایشگاهی استخراج:

این نوع کیت ها برای جداسازی DNA-RNA و پروتئین از سلول ها مورد استفاده قرار می گیرد. اساس کار این کیت ها به اینگونه است که خون، بافت تازه و یا فریز شده، سرم، عصاره گیاه و .. از ماده استخراج شده و در انواع تکنیک ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. کیت‌های استخراج دارای یک پروتکل کلی ثابت هستند که شامل چند محلول و ماده شیمیایی می‌باشد

کیت های استخراج انواع مختلفی دارد که به معرفی آنها میپردازیم:

الف ) کیت آزمایشگاهی استخراج DNA :

DNA یا دئوکسی ریبو نوکلئیک اسید ( Deoxyribonucleicacid ) نوعی اسید نوکلئیک است و یکی از ماکرومولکول‌های زیستی می‌باشد که در انتقال داده‌های ژنتیکی نقش دارد. این ماکرومولکول پلیمری از زیر واحدهای نوکلئوتیدی در ساختمان‌های دورشته‌ایی مارپیچی تشکیل شده است. DNA در هسته‌ی سلول‌های بافت، سرم، پلاسما، خون ( فقط گلبول های سفید) چون گلبول قرمز و پلاکت فاقد هسته می‌باشد، وجود دارد.

روش استخراج DNA و تعداد استخراج‌ها دارای کدهای مختلفی در برندهای مختلف هستند ولی پروتکل مشترک بین تمام روش‌های استخراج DNA بصورت زیر است :

• لیز سلول ها یا از بین بردن غشای سلولی :

در این مرحله از روش‌های فیزیکی و شیمیایی برای لیز سلول استفاده می‌شود. عمدتأ بافرهای لیز کننده حاوی دترجنت‌های یونی و غیریونی مثل SDS، تریتون X-100 و NP-40 برای لیز پروتئین‌های غشا و پروتئین‌های متصل به DNA و برای تنظیم اسیدیته و اسمولاریته برای لیز از مواردی مانند EDTA و Tris -HCL استفاده می‌شود.

• جداکردن DNA از سایر اجزای سلولی و خالص سازی DNA :

در این مرحله از فنل و کلرفرم استفاده می‌شود، اگر مقدار پروتئین در نمونه بالا باشد از پروتئیناز K استفاده می‌شود و برای از بین بردن RNA از RNase استفاده می‌شود.

• تغلیظ DNA :

این مرحله به معنی بالا بردن غلظت DNA در حجم محلول است و در این مرحله از اتانول ۹۶ درصد و ایزوپروپانول سرد استفاده می‌شود و در آخر این مرحله DNA به صورت کلاف‌هایی دیده می‌شود.

• شستشو :

دراین مرحله از اتانول ۷۰ درصد برای جداسازی نمک از رسوب DNA استفاده می‌شود.

ب ) کیت آزمایشگاهی استخراج RNA :

RNA یا ریبونوکلئیک اسید ( Ribonucleic acid ) یک اسید نوکلئیک تک رشته‌ای است که توسط DNA در هسته سلول ساخته می‌شود. RNA نقش مهمی در سنتز پروتئین دارد زیرا در رونویسی و رمز گشایی و ترجمه کدهای ژنتیکی برای تولید پروتئین نقش دارد و به سه نوع تقسیم می‌شود که شامل : ( tRNA ( transfer RNA و (mRNA (Messenger RNA و (rRNA (ribosomal RNA است.

روش استخراج RNA و تعداد استخراج دارای کدهای مختلفی در برندهای مختلف است ولی پروتکل مشترک بین آنها شامل موارد زیر است :

• برداشت بافت :

در این مرحله بافت مورد نظر توسط پروتئازها و گاهی تریپسین یا EDTA از میان مجموعه بافتی بدن جدا می‌شود.

• همگن سازی :

در این مرحله RNA باید از محاصره غشایی خارج شود و برای این عمل می‌توان از RNX-plus یا Trisol تریزول استفاده کرد.

• جداسازی فازها :

در این مرحله RNA را از DNA و پروتئین‌های سلولی جدا می‌کنند که از ماده کلروفرم جهت این کار استفاده می‌کنند و سپس محلول را سانتریفیوژ کرده و بعد محلول در ۳ فاز تفکیک می‌شود فاز رویین RNA، فاز میانی DNA و فاز زیرین پروتئین می‌باشد.

• رسوب سازی RNA :

فاز رویین مرحله قبل را به لوله‌ای دیگر انتقال داده و با استفاده از ایزوپروپانول و سانتریفیوژ رسوب RNA را ایجاد می‌کنند.

• شستشو RNA :

شستشو رسوب با استفاده از اتانول ۷۵ درصد

• محلول سازی RNA :

انحلال رسوب مرحله قبل توسط ماده‌ایی به نام DEPC treated water

• تجزیه و تحلیل RNA :

در مرحله آخر سنجش RNA با استفاده از الکتروفورز یا دستگاه اسپکتروسکوپی

ج ) کیت آزمایشگاهی استخراج پلاسمید :

پلاسمید Plasmid، یک مولکول dsDNA حلقوی کوچکی است که وارد سلول باکتری می‌شود و قادر به همانند سازی اما مستقل از ژنوم باکتری داخل سیتوپلاسم باکتری می‌باشد و به آسانی هم از باکتری استخراج می‌شود. پلاسمیدها در سلول‌های بسیاری از باکتری‌ها، آرکی باکتری‌ها، برخی گیاهان، قارچ‌ها، مخمرها بطور طبیعی دیده می‌شود ولی می‌توان آن را بصورت مصنوعی و تراریختی (ترانسفورماسیون) به سلول‌های جانوری نیز وارد کرد. پلاسمیدها در زیست شناسی سلولی و مولکولی برای دستکاری و رمزگشایی اطلاعات ژنتیکی از اهمیت بالایی برخوردار هستند.

روش استخراج پلاسمید یعنی خالص سازی DNA پلاسمید از DNA باکتری با استفاده از روش لیز قلیایی شامل موارد زیر است :

• رشد و آماده سازی سلولی :

در این مرحله باکتری‌هایی که دارای پلاسمید هستند را در محیط کشت مناسب رشد می‌دهند و بعد از آن به کمک سانتریفیوژ کردن باکتری‌ها را رسوب می‌دهند تا از محیط کشت جدا کنند.

• محلول سازی مجدد :

رسوب به دست آمده از مرحله قبل را در محلول( شامل تریس، EDTA، گلوکز و RNaseA ) حل می‌کنند.

• لیزکردن :

در این مرحله از بافر لیز کننده یعنی محلول شماره ۲ (شامل هیدروکسید سدیم NaoH و شوینده دو دسیل سولفات SDS ) استفاده می‌کنند که SDS باعث حل کردن غشای سلولی و همچنین باعث لیز شدن بیشتر پروتئین‌های درون سلولی می‌شود که به جداسازی بعدی پلاسمید از پروتئین کمک می‌کند.

• خنثی سازی :

در این مرحله محلول شماره ۳ که دارای استات سدیم است و باعث تغییر خاصیت قلیایی می‌شود را اضافه می‌کنند.

• تغلیظ و خالص سازی :

در این مرحله DNA پلاسمیدی از سایر اجزای سلول جدا شده اما هنوز در محلولی که مقادیر بالایی نمک، EDTA و Rnase و دیگر پروتئین‌ها را دارد، قرار گرفته است و باید پلاسمید توسط اتانول رسوب داده شده و خالص شود.

کیت های آمینواسید:

این کیت های آزمایشگاهی در پروژه هایی مانند صنایع دارویی، صنایع غذایی و … بسیار کاربرد دارند.

کاربرد کیت آزمایشگاهی

این کیت های تشخیصی برای آزمایش نمونه های بدست آمده از بدن انسان (خون ، ادرار و بافت) استفاده می شوند تا اطلاعاتی را برای اهداف غربالگری، تشخیص یا نظارت بر درمان ارائه دهند.

از آنها برای اندازه گیری برخی پارامترها از یک نمونه به منظور ارائه اطلاعات پیش آگهی، تشخیص عفونت و درمان در مورد آن پارامتر استفاده می شوند. در واقع کیت ها برای تعیین وضعیت سلامتی در نظر گرفته شده اند، بنابراین به منظور تأیید بیماری و یا عدم بیماری کیت های تشخیصی آزمایشگاهی ضروری هستند. بیشتر کیت های تشخیصی برای ارزیابی بیوشیمیایی و بررسی کیفی آنتی ژن یا آنتی بادی در نظر گرفته شده اند. قابل ذکر است که اکثر کیت های تشخیصی بالینی بر پایه الایزا می باشند.